时间: 2024-02-02 21:25:56 | 作者: 磁粉探伤机
临床前体外血脑屏障（BBB）模型领域取得了重大进展，从基于单层培养的系统发展到复杂的多细胞试验。但将这些模型与其他相关类器官系统结合起来，将血脑屏障通透性研究纳入药物分布和代谢的大背景中，这种方法仍然缺乏。本研究首次报道了在一个封闭的微流体系统（MPS）中将人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的血脑屏障模型与来自同一供体的大脑皮质和肝脏球体模型相结合的方法。两种模型化合物Atenolol和Propranolol被用来测量血脑屏障的渗透性和评估代谢情况。这两种物质都显示出类似体内渗透的行为，并在体外进行了代谢。因此，新型多器官系统不仅能测量母体化合物的浓度，还能测量代谢物在血脑屏障的分布情况。
结合多个器官模型：将人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的血脑屏障模型与同一供体的大脑皮层和肝脏球模型相结合，构建了一个封闭的微流控系统，实现了多个器官模型的整合。
药物渗透性和代谢评估：使用两种模型化合物阿替洛尔和，测量其在血脑屏障的渗透性，并评估其代谢过程，从而揭示了这种多器官系统在模拟体内药物行为方面的潜力。
未来发展趋势：研究提出了未来改进的方向，包括整合其他器官模型、优化神经血管单元模型、以及探索其他能够更好模拟血脑屏障的内皮细胞表型的研究方法。
在HUMIMIC Chip4中，使用一个PDMS层替换了正常包含肾脏模型微流环路的PDMS层，将肝脏模型转移到了该芯片中，并与BBB/脑模型结合。 BBB/脑Transwell模型插入到脑室中，底部的BMEC-like细胞直接暴露于流体流动下的100μm高通道中。
图 1. HUMIMIC Chip4 中 iPSC 衍生的 BBB/脑和肝共培养测定的设置。( A ) HUMUMIC101 iPSC 系分化为脑微血管内皮样细胞、神经球体、内皮细胞、间充质基质细胞和肝细胞样细胞的示意图。将脑微血管内皮样细胞和神经球体在96孔Transwell中组合，构建血脑屏障/脑模型①。将内皮细胞、间质基质细胞和肝细胞样细胞组合成50,000个细胞的球体，每个芯片中20个球体用作肝脏模型②。( B ) HUMIMIC Chip4 微流体的 2D 视图；替代血液回路以粉红色显示。在所描绘的电路中，介质储存器（混合 1）与肝脏 ① 和 BBB/脑 ② 模型的 24 孔肠室和 96 孔室互连。流体流动由片上微型泵产生；流动方向由箭头指示。( C ) HUMIMIC Chip4 中脑培养室 ① 的 3D 视图。隔室的底部由 PDMS 层 2 组成。在侧面，隔室由 PDMS 层 1 和通道板组成。可以将截止的 96 孔 Transwell（黄色虚线）插入隔室中，并使其边缘站在 PDMS 层 2 的 100 µm 高台阶上。在 Transwell 膜底部培养的内皮细胞因此直接暴露于流体从下方流过。
共培养的时间为7天，其中有5天的调整期和2天的处理期。每2-3天更换一次培养基。在试验结束时，进行不同的终点读数，如通过LC/MS测量物质浓度，TEER测量，免疫荧光染色，通过LCMS鉴定代谢物和基因表达分析。
图 2. 一周共培养的培养时间表和培养基参数。( A ) HUMIMIC Chip4 中动态共培养的示意图，这中间还包括培养基参数的过程测量和终点分析。器官模型在Chip4中总共培养7天，其中有5天的调整阶段和2天的治疗阶段。每 2-3 天更换一次培养基。测定结束时，进行不同的终点读数，例如通过 LC/MS 测量物质浓度、TEER 测量、免疫荧光染色、通过 LCMS 进行代谢物鉴定和基因表达分析。( B ) 三个实验的葡萄糖消耗、乳酸产生和乳酸/葡萄糖比率 (N = 3)。显示每个时间点 进行 3 至 6 次技术重复 ( n = 3–6)的每个实验的平均值 + sem 。
在HUMIMIC Chip4的肝脏模型中，使用了肝脏小球模型。肝脏小球是一种三维的肝脏模型，由肝细胞自组装而成，能更好地模拟肝脏的生理状态。在该文章中，肝脏小球模型在Chip4中培养，附着在小室底部，但在整个培养时间内保持其球形形态。通过一系列分析特征基因转录标记表达，比较了在Chip4中培养7天的肝脏小球与Chip4之前的肝脏小球以及在相同时间段内在静态条件下培养的肝脏小球的表达情况。结果显示，无论在哪种培养条件下，癌胚抗原（AFP）的表达都略有增加，而主要转运蛋白白蛋白的表达则随时间显著增加。
图 3. HUMIMIC Chip4 中的肝脏模型。( A ) 在 HUMIMIC Chip4 中与 BBB/脑模型共培养一周内具有 20 个肝球体的肝室的明场图像。( B ) iPSC 衍生的肝球体形成后（第 0 天）、在芯片共培养介质中 Chip4 培养 7 天后以及在肝脏成熟介质中静态培养 7 天后，肝脏相关基因的转录水平。数据表示为三个独立实验的平均值±sem (N = 3)。在y轴上，基因表达水平显示为与管家基因 TBP 的比率。来自三个不同代的 HUMIMIC hiPSC101 样本和来自三个供体的原代肝脏样本用作对照。使用 Tukey 事后检验进行双向方差分析，** p 0.01，* p 0.05。( C ) 在 Chip4 中培养 7 天之前和之后，iPSC 来源的肝球体中肝脏标记物白蛋白（红色）和 HNF-4α（白色）的免疫荧光染色；刻度为 100 µm。细胞核用 DAPI 染成蓝色。
研究者将BBB/brain模型培养在Chip4中，与肝模型共同培养。在Chip4中，BBB/brain模型的Transwell插入到脑室中，形成了一个100微米高的通道，使得培养在Transwell膜的底部的BMEC-like细胞直接暴露在流体流动中。结果显示，BMEC-like细胞在Transwell膜上生长成为一个紧密的单层，可以模拟血脑屏障的生理状态。在芯片中的肝脏小球模型和BBB/脑Transwell模型之间的共培养中，肝脏小球模型保持了其球形形态，并且在7天的培养期内表达了肝脏特异性基因。此外，通过测量药物的渗透性，该模型能够适用于评估药物通过血脑屏障的能力。
图 4. HUMIMIC Chip4 中的器官模型：肝脏和 BBB/脑模型。( A ) HUMIMIC Chip4 与肝脏模型共培养一周内 BBB/脑室的明场图像。在培养第 0 天的图像中，示例性地显示了 Transwell 的微流体室的位置和流动方向。( B ) 在 Chip4 中培养 7 天之前和之后添加和不添加物质的 TEER 值，来自每组 3-5 个芯片重复的两次实验 (N = 2) ( n = 3-5)。采用 Tukey 事后检验的单向方差分析，** p 0.01。( C ) 在 Chip4 中培养 7 天之前和之后，iPSC 衍生的 BMEC 样细胞培养物中内皮细胞和 BBB 标记物的免疫荧光染色；刻度为 50 µm。( D ) 与静态培养中的第 0 天和第 7 天相比，芯片培养后 BMEC 样细胞中的基因显着上调和下调。数据表示为第 0 天样本的对数倍数变化。分析了第 0 天 3 个实验的 6 个样品 (N = 3)、3 个实验中 Chip4 培养后的 8 个样品 (N = 3) 和静态培养第 7 天的 1 个样品 (N = 1)。显示了各个样品的表达水平和平均值±sem。统计显着性利用 Holm-Sidak 办法来进行多次t检验来校正多重比较，**** p 0.0001，*** p 0.001，** p 0.01，* p 0.05。每个基因均单独分析，不假设标准差 (SD) 一致。( E )左图：在Chip4中培养7天后，神经球中TUBb3阳性神经元祖细胞和GFAP阳性神经胶质祖细胞的免疫荧光染色；刻度为 250 µm。右图：左图标记区域的 GFAP 染色放大图；刻度为 50 µm。( F ) Chip4 培养 7 天后神经球中 ki67 阳性增殖细胞和 TUNEL 阳性凋亡细胞的免疫荧光染色；刻度为 250 µm。球体核心中增殖细胞外层和凋亡细胞之间的边界用虚线标记。( G ) MAP2 阳性神经元和突触素 (SYP) 的免疫荧光染色作为突触形成的标记，在 Chip4 中培养 7 天后进行染色；刻度为 250 µm。对于所有免疫荧光染色：细胞核用 DAPI 染色为蓝色。
研究者在Chip4培养7天后，向培养基中添加阿替洛尔和，并分析了其在培养基和脑室中的浓度。研究者还分析了培养基中葡萄糖、乳酸、LDH和白蛋白的浓度，以及它们在培养基和脑室中的分布情况。根据结果得出，葡萄糖在脑室中的浓度明显低于培养基中的浓度，而乳酸在脑室中的浓度明显高于培养基中的浓度。此外，LDH和白蛋白是大分子物质，在体内受到血脑屏障的限制，不能通过血脑屏障。
图 5. Chip4 中阿替洛尔和的渗透和代谢。( A ) Chip4 培养 5 天后循环 (Circ) 和脑室中葡萄糖、乳酸、LDH 和白蛋白的浓度。在一项实验中，在存在神经和肝脏球体的情况下，分析了12 块具有 BMEC 样细胞的芯片 ( n = 12) 和 3 块没有 BMEC 样细胞的芯片 ( n = 3)。y轴显示各个回路的物质浓度和平均值 + sem。通过双向方差分析与 Tukey 事后检验比较浓度差异（**** p 0.0001，*** p 0.001，** p 0,01，* p 0.05）。( B ) 物质施用后 48 小时，测量 Chip4 中和阿替洛尔的脑室和介质循环之间的浓度和比率。显示了两次实验（N = 2）的平均值（每个实验有四次和五次芯片重复）和标准差（SD）。( C ) 两个实验 (N = 2) 中测得的和阿替洛尔的脑室和介质循环之间的浓度比，有或没有 BMEC 样细胞 (N = 2)，每个条件重复 3 次和 5 次芯片重复 ( n = 3-5)。y轴显示平均浓度比 + sem。通过未配对的t检验比较循环和脑室之间的差异（* p 0.05，**** p 0.0001）。( D ) Chip4 中和阿替洛尔的拟议代谢途径。假定母体和代谢物具有相同的仪器响应。阿替洛尔代谢物的鉴定仅基于精确质量。( E ) 物质应用后 48 小时，和阿替洛尔代谢物在介质循环 (Circ) 和脑室之间的分布。分析了三个无细胞 Chip4 ( n = 3)、五个具有 BMEC 样细胞、神经和肝脏球体的 Chip4 ( n = 5) 以及三个没有 BMEC 样细胞但具有神经和肝脏球体的 Chip4 ( n = 3)。y轴显示各个电路的曲线下面积 (AUC) 值和平均值 + sem。虚线显示应用介质中的浓度。通过未配对的t检验比较循环和脑室之间的差异（**** p 0.0001，*** p 0.001）。
该研究在微流控 HUMIMIC Chip4 培养系统中实现了自体 iPSC 来源的肝脏和 BBB/脑模型的同时培养，并且分别评估了药物在肝脏和血脑屏障中的渗透和代谢。研究者发现，HUMIMIC Chip4-肝脏模型能够适用于评估药物通过肝脏的代谢和转运，而HUMIMIC Chip4-BBB/脑模型则能够适用于评估药物通过血脑屏障的渗透性。此外，研究者还分析了药物在培养基和脑室中的浓度，以及培养基中葡萄糖、乳酸、LDH和白蛋白的浓度，揭示了药物渗透和代谢的多种影响因素。这些根据结果得出，HUMIMIC Chip4-肝脏和HUMIMIC Chip4-BBB/脑模型能够适用于药物测试和评估，具备极其重大的应用前景。该研究为开发更安全、有效的药物提供了新的方法和思路。
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